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western blot的試驗(yàn)過(guò)程及注意事項(xiàng)的材料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳搬運(yùn)到硝酸纖維膜上。 
1）搬運(yùn)緩沖液洗刷凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回翻滾去除一切的氣泡。 
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用搬運(yùn)緩沖液浸濕），將凝膠夾在中心，堅(jiān)持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。 
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙依照廠家主張辦法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。 
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿搬運(yùn)緩沖液以吞沒(méi)凝膠。 
5）依照廠家所示接通電源開端電泳搬運(yùn)。 
6）搬運(yùn)完畢后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量規(guī)范閃現(xiàn)時(shí)取出，記載下規(guī)范方位。 
3. 用100ml水洗刷纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。 
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗刷薄膜。 
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。 
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。 
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u擺2小時(shí)（或4℃過(guò)夜） 
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗刷薄膜，每次75ml。 
10． 將銜接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u擺1小時(shí)。 
11． 按過(guò)程9洗刷。 
12． 參加抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u擺。 
注意事項(xiàng)： 
western blot中搬運(yùn)在膜上的蛋白處于變性狀況，空間結(jié)構(gòu)改動(dòng)，因而那些辨認(rèn)空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況能夠?qū)⒈磉_(dá)意圖蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的一切蛋白物素化，再用酶符號(hào)親和素進(jìn)行western blot。試驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。