如果遇到酶切不動(dòng)或切不*，該怎么辦？要回答這個(gè)問(wèn)題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們經(jīng)常遇到這樣的問(wèn)題：1個(gè)單位的酶能在60分鐘內(nèi)切1ug的DNA，為什么我們的DNA那么少切那么長(zhǎng)時(shí)間也不能切開(kāi)或切*? 今天晶抗解析酶切不動(dòng)或切不*有哪些原因?
1、酶是否有活性：
酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug λDNA或特定線狀DNA所需要的酶量。鑒定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是別的公司的酶來(lái)判定。因?yàn)椴煌久缚赡苁菑牟煌到y(tǒng)中純化的，雖然識(shí)別位點(diǎn)相同，但是酶的特性可能是有差異的。鑒定酶必須使用說(shuō)明書(shū)上認(rèn)定的酶活確定的方式，通常需要用λDNA做模板來(lái)判定。如果酶同時(shí)對(duì)甲基化敏感，還需要用Dcm-, Dam-的DNA。不排除由于運(yùn)輸或分裝不當(dāng)導(dǎo)致酶活性下降，這種情況是很少發(fā)生。
2、模板性質(zhì)是否清楚：
如果DNA的類型變了，所需要的酶量也不同。酶切效果與DNA的性質(zhì)(線狀，超螺旋狀)、位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對(duì)超螺旋狀DNA*酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍，同時(shí)需要提高酶的用量(10U/ug)和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。還有一個(gè)問(wèn)題是有些時(shí)候DNA是從別人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。
3、模板純度是否夠：
模板制備方式也會(huì)影響DNA的質(zhì)量，若在制備過(guò)程中使用到y(tǒng)i醇，氯f(wàn)ang，苯酚，SDS，EDTA等，如果這些物質(zhì)殘留在zui終的DNA模板中，那么都會(huì)不同程度影響酶的活性。Miniprep時(shí)如果用試劑盒抽提，需要考慮的污染問(wèn)題是變性劑和yi醇；如果是手工制備的，氯f(wàn)ang，yi醇，苯酚及細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)都會(huì)不同程度的干擾酶活性。
4、甲基化程度對(duì)酶的活性是否有影響：
細(xì)菌中主要有Dcm和Dam兩種甲基化方式，在植物和動(dòng)物細(xì)胞中主要是CG位被甲基化。仔細(xì)看看使用的 酶對(duì)甲基化的敏感情況，或許能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。
5、反應(yīng)條件是否合適：
對(duì)照說(shuō)明書(shū)，檢查使用的溫度是否正確，是否需要添加BSA, 是否使用正確的緩沖溶液。由于緩沖液中基本都含有DTT，反復(fù)凍融會(huì)使模板使DTT降解。注意有些研究人員將buffer長(zhǎng)時(shí)間放在4度或室溫，這是很不規(guī)范的行為。
6、酶稀釋和添加方式是否正確：
一般要求在zui后加酶，但是同時(shí)做多個(gè)相同反應(yīng)的時(shí)候，zui后加酶有可能不是很方便。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個(gè)混合物，然后分裝，zui后加模板。需要提醒的是混合物(Master Mix)中由于沒(méi)有底物的存在，離子強(qiáng)度也不對(duì)，酶可能會(huì)受到損傷。這種提前混合的做法沒(méi)有問(wèn)題，只是動(dòng)作要快一些，沒(méi)有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。
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