己烯雌酚類檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
己烯雌酚是甾類同化激素，被大量用于促進反芻動物的生長。但由于己烯雌酚存在明顯的致癌性，歐美等發(fā)達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。我國農(nóng)業(yè)部第235號文件中規(guī)定，動物源性食品中己烯雌酚的殘留*為不得檢出。
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的己烯雌酚和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含己烯雌酚含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中己烯雌酚的殘留量。
2 己烯雌酚類檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織（蝦、魚）………………………0.2ppb
豬肉/肝、雞肉/肝……………………2ppb
配合飼料………………………………10ppb
濃縮/預(yù)混飼料………………………20ppb
尿液……………………………………0.6ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
己烯雌酚………………………………100%
雙烯雌酚………………………………38.5%
己烷雌酚………………………………8.5%
己炔雌二醇……………………………<0.1%
雌三醇…………………………………<0.1%
 2.5 樣本回收率：
尿     樣   ……………………… 70%±10%
組     織   ……………………… 85%±10%
飼     料   ……………………… 90%±10%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準品：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、*、丙酮、濃磷酸（含量85%）
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：6M H3PO4 溶液
100ml 濃H3PO4（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。
配液2：2M NaOH溶液
    8gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3：1M NaOH溶液
    4g NaOH加去離子水100ml溶解。
配液4：乙腈-丙酮混合液
    V乙腈：V丙酮=4:1
配液5：復(fù)溶液
    將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)樣本處理方法 
1）稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振蕩2min，15℃4000r/min離心10min； 
2）取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干； 
3）加入0.5ml，振蕩20s，加入2ml 2M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min； 
4）取上清液1ml，加入200µl 6M H3PO4，振蕩5s； 
5）加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min離心10min，取上層有機相，60℃氮氣/空氣吹干； 
6）用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。
不同樣本按如下方法稀釋： 
A）蝦魚：直接取50µl水相用于檢測。 
    樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.2ppb
B）豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液，振蕩混合30s；取50µl用于檢測。
    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：2ppb
5.3.2 飼料樣本處理方法 
1）稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振蕩2min，15℃ 4000r/min離心10min； 
2）取2ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干； 
3）加入0.5ml，振蕩20s，加入2ml 1M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min； 
4）取1ml上清液，加入100µl 6M H3PO4，振蕩5s；
不同樣本按如下方法稀釋： 
A）配合料：取50µl，加入950µl樣本復(fù)溶液，振蕩混勻30s，取50µl 用于檢測。
    樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：10ppb
B)濃縮料/預(yù)混料：取25µl，加入975µl樣本復(fù)溶液，振蕩混勻30s，取50µl 用于檢測。
    樣本釋倍數(shù)：200    檢測下限：20ppb 
5.3.3 尿樣樣本處理方法 
1）取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min離心10min，直至清亮； 
2）移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml 1M NaOH強烈振蕩5min； 
3）加入100µl 6M H3PO4，振蕩30 s； 
4）再加入8ml進行萃取，振蕩5min。15℃4000r/min離心10min； 
5）去掉上層的水相，取下層有機相4 ml，60℃氮氣吹干； 
6）用3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物，混合30s；
7）取50µl用于分析。 
    樣本稀釋倍數(shù)：6    檢測下限：0.6ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
   將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標準品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
   以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
   若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。